近年來(lái)，一種新興的納米材料金屬納米簇逐漸成為生物傳感與生物成像等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。金屬納米簇通常是由兩個(gè)至幾十個(gè)原子構(gòu)成的納米顆粒，尺寸一般不超過(guò)2nm，介于金屬原子和納米顆粒之間。金屬納米簇具有特殊尺寸，因此連續(xù)電子能級(jí)會(huì)分裂成離散能級(jí)使其具有特殊的光學(xué)以及電學(xué)性質(zhì)。目前常用的金屬納米簇主要包括金納米簇、銀納米簇以及銅納米簇，其中銅納米簇比金、銀納米簇具備更多的優(yōu)點(diǎn)，如成本極低、生物安全性高及反應(yīng)條件更加接近生理環(huán)境等。因此，銅納米簇作為一種新型納米探針在金屬離子、生物小分子、蛋白質(zhì)、核酸、酶的分析檢測(cè)以及細(xì)胞成像等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。

近日，中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)室的楊大威等科研人員以DNA為模板、硫酸銅為原料、抗壞血酸為還原劑合成了銅納米簇，并基于該銅納米簇分別實(shí)現(xiàn)了堿性磷酸酶及核酸內(nèi)切酶的活性檢測(cè)。

堿性磷酸酶是一種廣泛分布在生物膜上的酶，可以催化核酸、蛋白質(zhì)等分子脫掉磷酸基團(tuán)。堿性磷酸酶可以參與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡等過(guò)程，同時(shí)可以作為肝炎、前列腺癌及骨癌的診斷標(biāo)記分子。因此，實(shí)現(xiàn)堿性磷酸酶活性的超靈敏檢測(cè)在基礎(chǔ)生物學(xué)研究及臨床診斷方面均有重要意義。目前堿性磷酸酶活性檢測(cè)的主要方法為比色法、電化學(xué)法及表面增強(qiáng)拉曼光譜法，這些方法均需要專業(yè)的設(shè)備，且靈敏度較低。發(fā)展成本低廉、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的堿性磷酸酶顯得尤為重要。蘇州醫(yī)工所科研人員首先基于合成的銅納米簇的熒光特性，實(shí)現(xiàn)了堿性磷酸酶活性的靈敏檢測(cè)。在這一工作中，堿性磷酸酶的存在，可以將無(wú)還原性的磷酸-抗壞血酸水解為具有還原性的抗壞血酸，進(jìn)而將Cu2+還原為Cu+，繼而觸發(fā)“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)，生成長(zhǎng)鏈DNA，以此為模板合成銅納米簇，通過(guò)檢測(cè)銅納米簇的熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)堿性磷酸酶的超靈敏檢測(cè)。該檢測(cè)體系的檢測(cè)范圍為0.1-40U/mL，檢測(cè)限為0.05U/mL。

EcoRI核酸內(nèi)切酶是一種常用的限制性核酸內(nèi)切酶，可以識(shí)別特殊的核酸位點(diǎn)，剪切磷酸二酯鍵。核酸內(nèi)切酶作為一種重要的工具酶，可廣泛參與DNA復(fù)制、重組，分子克隆以及基因編輯等過(guò)程中。因此實(shí)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶活性的檢測(cè)在基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究及臨床診斷方面均具有重要的意義。目前核酸內(nèi)切酶活性檢測(cè)常用的方法包括凝膠電泳法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、比色法以及電化學(xué)發(fā)光法，然而這些方法均具有操作復(fù)雜、原料昂貴以及靈敏度低等缺點(diǎn)。因此設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單易行、靈敏度高的核酸內(nèi)切酶活性檢測(cè)方法尤為必要。蘇州醫(yī)工所科研人員以雙鏈DNA為模板合成的銅納米簇作為電信號(hào)探針，用電化學(xué)手段實(shí)現(xiàn)了核酸內(nèi)切酶活性的靈敏檢測(cè)。在這一工作中，首先將雙鏈DNA修飾在金電極上，當(dāng)核酸內(nèi)切酶不存在時(shí)，以金電極上的雙鏈DNA為模板可以合成銅納米簇，銅納米簇可以溶解沉積到玻碳電極上，進(jìn)而可以檢測(cè)其電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)核酸內(nèi)切酶存在時(shí)，其可以識(shí)別和剪切電極表面上的雙鏈DNA，電極表面銅納米簇不能生成，即不能檢測(cè)到電化學(xué)信號(hào)。因此，在這一檢測(cè)方法中可以通過(guò)檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶活性的檢測(cè)，該檢測(cè)體系的檢測(cè)范圍為10-3-10 U/mL，檢測(cè)限為10-3U/mL。

相關(guān)研究成果發(fā)表在ACS Appl. Nano Mater.和Analyst上。該研究得到了國(guó)家重大科研裝備研制項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金等的資助。

圖1.A，銅納米簇?zé)晒獍l(fā)射光譜（堿性磷酸酶濃度: 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、20、40U/mL）；B，堿性磷酸酶活性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；C，檢測(cè)體系的特異性驗(yàn)證；D，礬酸鈉對(duì)堿性磷酸酶活性的抑制效應(yīng)。

圖2.A，核酸內(nèi)切酶作用前后電泳圖及DNA不同修飾階段電化學(xué)阻抗圖；B，加入核酸內(nèi)切酶前后的循環(huán)伏安圖（核酸內(nèi)切酶存在a、核酸內(nèi)切酶不存在b）；C，差分脈沖伏安曲線（核酸內(nèi)切酶濃度：10?3、5×10?3、10?2、5×10?2、10?1、5×10?1、1、5、10、50U/mL從下到上)；D，核酸內(nèi)切酶檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。