2019年10月14日，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所徐濤院士課題組與徐平勇課題組合作，在《Nature Methods》上發(fā)表了題為 “mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM” 的研究論文。他們發(fā)展了第一個(gè)常規(guī)電鏡制樣后保持熒光的光轉(zhuǎn)化熒光蛋白，首次實(shí)現(xiàn)了Epon后固定的同層超薄樣品的超分辨光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)成像，極大地促進(jìn)了超分辨光鏡和電鏡成像領(lǐng)域的發(fā)展，有望帶來(lái)生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用。
蛋白質(zhì)等分子在細(xì)胞中的特定位置組裝成蛋白質(zhì)機(jī)器進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能，因此研究蛋白質(zhì)等分子在細(xì)胞中的精確定位對(duì)于揭示蛋白質(zhì)機(jī)器的組裝和分子機(jī)制至關(guān)重要。電子顯微鏡具有亞納米尺度的空間分辨率，是生命科學(xué)領(lǐng)域中不可缺少的研究工具。然而在電鏡圖像中定位目標(biāo)蛋白具有很大的挑戰(zhàn)。例如常用的免疫電鏡利用抗原—抗體反應(yīng)在電鏡圖像中標(biāo)記和定位蛋白質(zhì)，該方法標(biāo)記效率低，而且對(duì)抗體的特異性依賴性很大。近年來(lái)出現(xiàn)的光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)成像技術(shù)是一種雙模態(tài)成像技術(shù)，該技術(shù)利用光鏡成像來(lái)定位目標(biāo)分子，標(biāo)記效率和特異性高，同時(shí)還可利用電鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)成像。超分辨光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)是更先進(jìn)的光電關(guān)聯(lián)技術(shù)，其中超分辨光鏡打破了光學(xué)衍射極限，將成像的空間分辨率提高到幾十納米。
光電關(guān)聯(lián)技術(shù)的核心難點(diǎn)是電鏡制樣后熒光分子無(wú)法保持熒光。當(dāng)前光電關(guān)聯(lián)成像一般是先用光鏡對(duì)整個(gè)細(xì)胞成像，然后再固定和包埋電鏡制樣，導(dǎo)致電鏡成像中不容易找到光鏡圖像中的同一細(xì)胞，而且整體細(xì)胞的光鏡圖像與超薄切片的電鏡圖像關(guān)聯(lián)不準(zhǔn)。常規(guī)電鏡制樣方法，包括使用1% 鋨酸固定來(lái)保持細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和電鏡襯度，以及使用Epon包埋來(lái)保證樣品的切片質(zhì)量，能夠獲得高質(zhì)量的電鏡圖片，并可應(yīng)用于大尺度生物樣品如腦組織的連續(xù)切片和3D重構(gòu)。因此，急需發(fā)展抗鋨酸固定和Epon包埋的熒光蛋白，在電鏡制樣的超薄切片中保持熒光，實(shí)現(xiàn)真正的光電關(guān)聯(lián)。
本研究中，團(tuán)隊(duì)成員發(fā)展了第一個(gè)抗鋨酸固定和Epon包埋的熒光蛋白，該熒光蛋白在電鏡制樣后仍然保持熒光并具有光開關(guān)的活性，通過優(yōu)化超薄切片中單分子定位算法和成像方法，首次實(shí)現(xiàn)了Epon后固定電鏡樣品的同層超分辨光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)成像。該光電關(guān)聯(lián)成像方法很好地保留了電鏡圖像中線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并具有單分子定位超分辨光鏡成像的單分子定位精度。利用該技術(shù)合作團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了線粒體和核膜的光電關(guān)聯(lián)成像（圖1）。該熒光蛋白將在神經(jīng)以及腦科學(xué)等需要對(duì)大尺度厚樣品進(jìn)行連續(xù)切片和3D重構(gòu)的光電關(guān)聯(lián)中得到廣泛應(yīng)用。
徐濤院士領(lǐng)銜的儀器研發(fā)團(tuán)隊(duì)近年來(lái)致力于顯微成像儀器設(shè)備和技術(shù)方法的研究和開發(fā)，先后研制出偏振單分子干涉成像、冷凍單分子定位成像以及超分辨光電融合成像系統(tǒng)，開發(fā)了多種新的超分辨顯微成像方法。徐平勇課題組主要致力于發(fā)展多種用于超分辨成像如PALM/STORM、SOFI、SIM等的探針，并基于探針的光化學(xué)特性發(fā)展新的成像方法如貝葉斯單分子超分辨成像方法SIMBA等，來(lái)提高超分辨成像的時(shí)空分辨率。該工作是徐濤院士課題組/徐平勇課題組合作，繼PALM成像探針mEos3.2（Nature Methods，2012）、活細(xì)胞超分辨成像方法Quick-SIMBA（Nano Letter，2019）后在超分辨成像領(lǐng)域取得的又一重要研究成果。
徐濤院士、張名姝副研究員和徐平勇研究員為該文章的共同通訊作者，付志飛、彭鼎銘、張名姝為共同第一作者。
該工作受到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中科院先導(dǎo)專項(xiàng)、中科院科研儀器設(shè)備研制項(xiàng)目、以及北京市科技計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。
